Nanopartikel

Jan 31, 2024

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 534 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Netzhaut-Müller-Gliazellen fungieren bei Zebrafischen, nicht aber bei Säugetieren, als verletzungsbedingte stammähnliche Zellen. Allerdings wurden Erkenntnisse aus Zebrafischen genutzt, um entstehende regenerative Reaktionen in der Netzhaut von Säugetieren zu stimulieren. Beispielsweise regulieren Mikroglia/Makrophagen die Müller-Glia-Stammzellaktivität bei Küken, Zebrafischen und Mäusen. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Immunsuppression nach einer Verletzung durch das Glukokortikoid Dexamethason die Regenerationskinetik der Netzhaut bei Zebrafischen beschleunigt. In ähnlicher Weise verbessert die Mikroglia-Ablation die Regenerationsergebnisse in der Netzhaut der Maus. Eine gezielte Immunmodulation der Mikroglia-Reaktivität kann daher das regenerative Potenzial von Müller-Glia für therapeutische Zwecke steigern. Hier untersuchten wir mögliche Mechanismen, durch die Dexamethason nach einer Verletzung die Regenerationskinetik der Netzhaut beschleunigt, und die Auswirkungen der Dendrimer-basierten Ausrichtung von Dexamethason auf reaktive Mikroglia. Intravitale Zeitrafferaufnahmen zeigten, dass Dexamethason nach der Verletzung die Mikroglia-Reaktivität hemmte. Die Dendrimer-konjugierte Formulierung: (1) verringerte die Dexamethason-assoziierte systemische Toxizität, (2) richtete Dexamethason auf reaktive Mikroglia aus und (3) verbesserte die regenerationsfördernden Wirkungen der Immunsuppression durch Erhöhung der Stamm-/Vorläuferproliferationsraten. Abschließend zeigen wir, dass das Gen rnf2 für den verstärkten Regenerationseffekt von D-Dex erforderlich ist. Diese Daten unterstützen den Einsatz von Dendrimer-basiertem Targeting reaktiver Immunzellen, um die Toxizität zu reduzieren und die regenerationsfördernde Wirkung von Immunsuppressiva in der Netzhaut zu verstärken.

Neurodegenerative Erkrankungen werden durch den fortschreitenden Verlust einzelner neuronaler Zelltypen verursacht. Bei Säugetieren ist dieser Verlust typischerweise dauerhaft, da sich Neuronen des Zentralnervensystems (ZNS) normalerweise nicht regenerieren. Daher sind Therapien zur Regeneration verlorener Neuronen erforderlich, um die Nervenfunktion bei Patienten mit dieser Krankheitsklasse wiederherzustellen. Im Gegensatz zu Säugetieren weisen Fische eine robuste Fähigkeit zur neuronalen Regeneration auf1,2. In der Netzhaut des Zebrafisches fungieren Müller-Gliazellen (MG) als verletzungsbedingte multipotente neurale Stammzellen, die in der Lage sind, alle Netzhautneuronen schnell zu regenerieren3,4. Studien an Zebrafischen haben Faktoren aufgedeckt, die bei Mäusen ein begrenztes Maß an Nervenreparatur stimulieren können, was zeigt, dass MG bei Säugetieren weiterhin das Potenzial hat, als retinale Stammzellen zu fungieren5,6,7,8,9,10. Insgesamt deuten diese Studien darauf hin, dass Therapien, die die MG-Regenerationsfähigkeiten verbessern können, eine Möglichkeit darstellen könnten, durch eine neurodegenerative Erkrankung der Netzhaut verlorene Neuronen zu ersetzen und so die Wiederherstellung der Sehfunktion zu ermöglichen11.

Die Forschung zu neuroimmunen Wechselwirkungen hat sich weitgehend entweder auf entwicklungsbedingte Rollen oder die schädlichen Folgen einer chronischen Neuroinflammation während der Neurodegeneration konzentriert12,13. Studien, die sich auf die Rolle des Immunsystems während der Netzhautregeneration konzentrieren, deuten auf mögliche unterschiedliche Funktionen zwischen den Arten hin. Studien an Küken deuteten zunächst darauf hin, dass Mikroglia/Makrophagen die Reaktivität und Proliferation von MG als Reaktion auf den Verlust neuronaler Zellen regulieren14,15. Umgekehrt stellten wir fest, dass die Immunsuppression einen kontextabhängigen Effekt auf die Regenerationskinetik der Stäbchen-Photorezeptoren in der Netzhaut der Zebrafischlarve hatte. Die Exposition gegenüber Dexamethason (Dex) vor dem Verlust der Netzhautzellen hemmte die Mikroglia-Reaktivität, verringerte die MG-Proliferationsraten und hemmte den Regenerationsprozess um etwa 40 %. Bei Anwendung nach Beginn des Zellverlusts beschleunigte Dex jedoch die Regenerationskinetik der Stäbchenzellen um etwa 30 %16. In ähnlicher Weise hemmte die gleichzeitige Ablation von Mikroglia und Photorezeptoren die Netzhautregeneration bei Zebrafischlarven. Im Gegensatz dazu steigerte die Mikroglia-Ablation nachweislich das Regenerationspotenzial in der Netzhaut der Maus17. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen haben Silva et al. fanden heraus, dass die Behandlung mit Dex vor der Verletzung die Mikroglia-Aktivierung, die Zytokinproduktion, die MG-Proliferation und die Photorezeptorregeneration bei erwachsenen Fischen unterdrückte18. In ähnlicher Weise fördern akute Entzündungsreaktionen die Regeneration des Sehnervs beim Zebrafisch, längere Dex-Behandlungen hemmten jedoch die Reparatur19. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass eine kontextabhängige Modulation der Reaktivität des Immunsystems genutzt werden könnte, um regenerative Reaktionen auf neuronalen Verlust zu fördern.

Leider ist bekannt, dass die systemische Immunmodulation eine Reihe systemischer, oft schädlicher Nebenwirkungen mit sich bringt20. Daher ist es problematisch, unsere Ergebnisse ausschließlich auf die immunsuppressive Aktivität von Dex zurückzuführen. Die gezielte Abgabe von Immunsuppressiva an reaktive Immunzellen auf Nanopartikelbasis könnte dabei helfen, die Auswirkungen während der neuronalen Degeneration und Regeneration aufzuklären. Darüber hinaus könnte das zelluläre Targeting systemische Toxizitätsprobleme ansonsten wirksamer Medikamente wie Glukokortikoide reduzieren. Darüber hinaus können Nanopartikel den Transport kleiner Moleküle über die Blut-Hirn- und Blut-Netzhaut-Schranke erleichtern21. Beispielsweise haben wir gezeigt, dass Hydroxyl(poly)amidoamin (PAMAM)-Dendrimer-Nanopartikel das Targeting von Arzneimittelkonjugaten auf reaktive Mikroglia/Makrophagen sowie andere phagozytische Zellen wie retinale Pigmentepithelzellen (RPE) bei mehreren entzündungsassoziierten Erkrankungen ermöglichen Krankheitsmodelle22,23,24,25,26,27,28. Dendrimere sind wohldefinierte baumartige Moleküle, die mit einer präzisen Größe, Ladung und einem präzisen Molekulargewicht synthetisiert werden können29,30,31. Die Oberflächengruppen sind für die Konjugation mit mehreren Ladungstypen pro Molekül geeignet (z. B. Medikamente, Targeting-Einheiten, Biologika und Bildgebungsmittel). Im Zusammenhang mit dem Auge führte die Dendrimer-basierte Ausrichtung von Dex auf aktivierte Makrophagen zu verbesserten klinisch relevanten Messungen in einem Kaninchenmodell für autoimmune Dakryoadenitis32 und zeigte in jüngerer Zeit neuroprotektive Wirkungen in der Netzhaut in einem Rattenmodell für Glaukom27. Darüber hinaus befindet sich ein Hydroxyl-Dendrimer-Wirkstoff-Konjugat in frühen klinischen Studien zur Behandlung von Entzündungen im Zusammenhang mit COVID-19 und zur Behandlung von Neuroinflammationen bei zerebraler Adrenoleukodystrophie im Kindesalter (klinische Studien NCT04458298 bzw. NCT03500627). Diese Daten zeigen, dass Dendrimer-Wirkstoff-Konjugate Neuroinflammationen in neurodegenerativen Zusammenhängen unterdrücken können22.

Hier untersuchten wir mögliche Mechanismen, durch die Dex nach der Ablation die Regenerationskinetik verbessert, und bewerteten die Auswirkungen der Konjugation von Dex an Dendrimer-Nanopartikel im Hinblick auf Mikroglia-Targeting, Mikroglia-Reaktivität, Proliferationsraten retinaler Stamm-/Vorläuferzellen und retinaler Regenerationskinetik. In-vivo-Zeitrafferaufnahmen mit adaptiver optikkorrigierter Gitterlichtblattmikroskopie (AO-LLSM)33,34 zur Bereitstellung einer erheblich verbesserten räumlich-zeitlichen Auflösung zeigten Dex-induzierte Veränderungen in der Mikroglia-Reaktivitätsdynamik. Darüber hinaus zeigen wir Hinweise darauf, dass Dendrimer-konjugiertes Dex (D-Dex), indem es Dex auf reaktive Immunzellen richtet, die Toxizität reduziert, die Mikroglia-Reaktivität auflöst und die Regenerationskinetik der Netzhaut im Vergleich zu freien Dex-Kontrollen verbessert. Der letztgenannte Befund war damit verbunden, dass D-Dex die Proliferationsraten retinaler Stamm-/Vorläuferzellen erhöhte. Schließlich ergab ein kleines CRISPR/Cas9-basiertes Screening, dass rnf2 für die regenerationsfördernde Wirkung von D-Dex erforderlich ist. Zusammengenommen unterstützen diese Erkenntnisse die Entwicklung von auf Nanotechnologie ausgerichteten Immunmodulationsstrategien zur Förderung der neuronalen Regeneration.

Eine zuvor veröffentlichte Nitroreduktase (NTR) exprimierende transgene Linie, die den Prodrug-induzierten Stäbchenzelltod erleichtert, Tg(rho:YFP Eco. NfsB)gmc50035 (im Folgenden NTR-Stäbchenfisch), wurde verwendet, um die Auswirkungen der Dex-Behandlung nach der Ablation auf Mikroglia zu untersuchen Reaktivität, RNA-Expression, MG-Proliferation und Kinetik der Stäbchenregeneration. In dieser Linie ermöglicht die Expression eines YFP-NTR-Fusionsproteins in Stäbchenzellen eine selektive Zellablation nach einer 24-stündigen Behandlung mit dem Prodrug Metronidazol (Mtz). Wie bereits in den Referenzen gezeigt. 16,35,36,37 führte die Behandlung von NTR-Stäbchenlarven mit 10 mM Mtz 5 bis 6 Tage nach der Befruchtung (dpf) zum Verlust von Stäbchenzellen und anschließender Regeneration, was durch intravitale Zeitreihenbilder bestätigt wurde, die vor der Ablation bei 5 dpf aufgenommen wurden (vor Mtz), nach Ablation (nach Mtz, 7 dpf) und nach Regeneration (nach Mtz, 9 dpf; ergänzende Abbildung 1a). Um die Ablation von Stäbchenzellen weiter zu bestätigen, wurden mit ±Mtz bei 5 dpf behandelte Larven bei 6 dpf gesammelt und Netzhautschnitte auf TUNEL (terminale Desoxynukleotidyltransferase (TdT)-vermittelte dUTP-Nick-End-Markierung), einen Marker für DNA-Schäden und Zelltod, gefärbt. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg der Anzahl von TUNEL+-Zellen in der äußeren Kernschicht (ONL) von Mtz-behandelten Netzhäuten im Vergleich zu nicht ablatierten Kontrollen (p ≤ 0,0001, ergänzende Abbildung 1b, c).

Unsere vorherige Charakterisierung der Auswirkungen der Immunsuppression auf die Regeneration der Netzhaut zeigte, dass Dex die Regeneration von Stäbchen-Photorezeptoren je nach Zeitpunkt der Behandlung entweder hemmen oder fördern kann. Eine Vorbehandlung mit Dex vor der Einleitung der Ablation von Stäbchenzellen hemmte die Regeneration; Wenn Dex jedoch einen Tag nach Beginn des Stäbchenzellverlusts angewendet wurde, beschleunigte sich die Regenerationskinetik der Stäbchen-Photorezeptoren16. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Dex-Behandlung das Überleben der Stäbchenzellen stimuliert, anstatt die Regeneration zu fördern, dh als Neuroprotektivum zu wirken, haben wir das Protokoll geändert und die YFP-Werte bei 7 dpf statt bei 9 dpf gemessen (ergänzende Abbildung 2a). Zu diesem Zeitpunkt wird der maximale Verlust des YFP-Signals bei Nur-Mtz-Kontrollen beobachtet (siehe ergänzende Abbildung 1a). Dies erleichtert Tests auf neuroprotektive Wirkungen, wie wir kürzlich in einem groß angelegten Screening durchgeführt haben, um Verbindungen zu identifizieren, die das Überleben von Stäbchenzellen fördern36. Die Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung mit Dex (2, 5 μM) nach Auslösung des Stäbchenzellverlusts, dh nach einer 24-stündigen Mtz-Exposition, keinen Einfluss auf das Überleben der Stäbchenzellen hatte (ergänzende Abbildung 2b).

In unserer vorherigen Studie zeigte die In-vivo-Zeitrafferbildgebung, dass die Vorbehandlung mit Dex die Reaktivität der Mikroglia gegenüber dem Stäbchenzelltod hemmte (gemessen an der gesamten Migrationsstrecke sowie der Verdrängung)16. Es bleibt jedoch unbekannt, wie die Mikroglia-Dynamik durch die Dex-Behandlung nach der Ablation, das Paradigma, das die Regeneration förderte, beeinflusst wurde. Um dieses Problem anzugehen, verwendeten wir eine leistungsstarke intravitale Mikroskopietechnik, die vom Betzig-Labor entwickelt wurde, AO-LLSM33,39, um die räumliche und zeitliche Auflösung der Mikroglia-/Makrophagendynamik während der In-vivo-Zeitrafferbildgebung der Netzhaut von Zebrafischlarven zu erhöhen. Konkret wurden Netzhautvolumina von 30–90 Mikron in Zeitskalen von 30 bis 180 Sekunden/Intervall gescannt – also bis zu 20-mal schneller als in unserer vorherigen Studie –, um die Auswirkungen der Dex-Behandlung nach der Ablation auf das Verhalten von Mikroglia/Makrophagen zu bewerten in der Nähe sterbender Stäbchenzellen.

Für die AO-LLSM-Bildgebung wurden NTR-Stabfische mit einer transgenen Linie gekreuzt, die Mikroglia/Makrophagen mit einem komplementären Fluoreszenzreporter markiert (tdTomato, Tg(mfap4.1:Tomato-CAAX)xt6). Doppelt markierte transgene Larven wurden ausgewählt und 24 Stunden lang mit ± Mtz bei 5 dpf behandelt, Mtz wurde dann entfernt und die Larven in jeder Gruppe wurden mit ± 2,5 μM Dex behandelt. Für alle vier Behandlungsgruppen wurde ab 6,5 dpf (12 Stunden nach der Dex-Behandlung) eine hochauflösende Zeitrafferaufnahme der Wechselwirkungen zwischen Mikroglia und Stäbchenzellen durchgeführt. Markierte Zellen wurden in Imaris 4D-gerendert, um die automatisierte Quantifizierung von drei etablierten Metriken der Mikroglia-/Makrophagen-Reaktivität zu ermöglichen: Migrationsgeschwindigkeit, Verschiebung und Sphärizität. Jede Metrik wurde über mehrere Mikroglia pro Fisch gemittelt und über mehrere Fische pro Bedingung verglichen (insgesamt 66 Zellen bei 21 analysierten Fischen). Mikroglia in nicht abgetragenen Kontrolllarven (unbehandelt), die nur mit Dex (+Dex) behandelt wurden, zeigten typischerweise verzweigte Morphologien, die zelluläre Prozesse aktiv ausdehnten und zurückzogen, blieben jedoch relativ nicht wandernd und verlagerten sich typischerweise nicht in die Photorezeptorzellschicht, konsistent mit einem nicht reaktiven homöostatischen Zustand (Abb. 1a, b und Zusatzfilme 1, 2). Mikroglia in Stäbchenzellen-ablatierten Larven (+Mtz) wurden hochbeweglich und wanderten schnell in und zwischen sterbenden Stäbchenzellen, wobei die Mehrheit eine amöboide Morphologie aufwies, die auf einen reaktiven Zustand hindeutet (Abb. 1c und Zusatzfilm 3). Im Gegensatz dazu schienen Mikroglia in stäbchenablatierten Larven, die 24 Stunden nach der Induktion des Stäbchenzellverlusts (+Mtz, +Dex) mit Dex behandelt wurden, weniger beweglich zu sein und zeigten eine Mischung aus verzweigten und amöboiden Morphologien, wobei die ersteren sich ausdehnen und zurückziehen, ähnlich wie bei unbehandelten Mikroglia Kontrollfische (Abb. 1d und Zusatzfilm 4). Interessanterweise wurden in Gegenwart von Dex verzweigte Mikroglia sogar in der degenerierenden Stäbchenzellschicht beobachtet (Zusatzfilm 4). Die Imaris-basierte Quantifizierung zeigte einen statistisch signifikanten Anstieg der Mikroglia-Migrationsgeschwindigkeit bei +Mtz-Stäbchenzell-ablatierten Larven im Vergleich zu einer der nicht-ablatierten Kontrollen (unbehandelt, 36,6 %, p = 0,0107; +Dex, 38,9 %, p = 0,0046) und bis +Mtz, +Dex-Larven (58,7 %, p = 0,0051; Abb. 1e). Die letzten drei Bedingungen zeigten nicht unterscheidbare Migrationsgeschwindigkeiten, was darauf hindeutet, dass Dex die Mikroglia-Migration im Post-Ablations-Paradigma unterdrückte (Abb. 1e). In ähnlicher Weise wurde eine statistisch signifikante Abnahme (~ 29 %, p = 0, 0239) der Mikroglia-Verdrängung bei + Mtz- und + Dex-Larven im Vergleich zu reinen Mtz-Fischen beobachtet (Abb. 1f). Interessanterweise wurden unter allen Bedingungen keine quantifizierbaren Änderungen der relativen Sphärizität festgestellt (Abb. 1g). In Übereinstimmung mit unseren früheren Ergebnissen16 zeigen diese Daten eine Zunahme der Mikroglia-Migration und -Verdrängung als Reaktion auf den Verlust von Stäbchenzellen. Darüber hinaus scheint die Dex-Behandlung nach der Ablation Mikroglia in einen relativ weniger beweglichen, möglicherweise nicht reaktiven Zustand zurückzubringen, der den Verhaltensweisen, die bei nicht ablatierten Kontrollnetzhäuten beobachtet werden, sehr ähnelt.

a–d Bildstills im Abstand von 6 Minuten zur AO-LLSM-Bildgebung von 5 oder 6 dpf transgenen Linien, die NTR-exprimierende Stäbchen (gelb) und Mikroglia/Makrophagen (cyan) markieren. Es wurden vier Zustände abgebildet: nicht ablatierte „unbehandelte“ Kontrolle (A), nicht ablatierte „+Dex“ (B), ablatierte Stäbchenzellen „+Mtz“ (C) und mit Dex-Behandlung ablatierte Stäbchenzellen „+“. Mtz, +Dex“ (D). In allen Bildern befindet sich die innere Kernschicht rechts von den NTR-YFP-Stäbchenzellen. z. B. Imaris-Quantifizierung der durchschnittlichen Migrationsgeschwindigkeit (μm/Sekunde), der durchschnittlichen Verschiebung (μm) und der relativen Sphärizität der Mikroglia in jeder Larve, Stichprobengrößen für jede Parzelle von links nach rechts: 5, 6, 5, 6 mit einer Gesamtsumme von 66 Mikroglia analysiert. Siehe Zusatzfilme 1–4, die jeweils den Standbildern AD entsprechen. Sternchen weisen auf statistisch signifikante Unterschiede zwischen den angegebenen Gruppen hin (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01), alle anderen Vergleiche waren statistisch nicht signifikant. Linien innerhalb der Geigendaten für jede Bedingung für alle Diagramme zeigen das untere Quartil (unten), den Median (mittlere Linie) und das obere Quartil (oben) an.

Um die Möglichkeit zu kontrollieren, dass Mtz die Mikroglia-/Makrophagenaktivität ohne Stäbchenablation beeinflusst, wurde eine intravitale konfokale Zeitrafferbildgebung bei Mtz-behandelten Larven durchgeführt, die nur das Mikroglia-markierende Transgen exprimierten. Eine 12-stündige Zeitraffersequenz, die unmittelbar nach der Mtz-Exposition gestartet wurde, zeigt, dass qualitativ keine nennenswerte Veränderung der Mikroglia-Reaktivität erkennbar war (Zusatzfilm 5). Bildstills über 2-Stunden-Intervalle zeigen, dass die überwiegende Mehrheit der Mikroglia verzweigt blieb und nicht in eine bestimmte Region der Netzhaut wanderte (ergänzende Abbildung 3a und ergänzender Film 5). Als nächstes wurden 4-stündige Zeitraffersequenzen verwendet, um das Verhalten von Mikrogliazellen zwischen unbehandelten Kontrollen (−Mtz) und +Mtz-Larven zu vergleichen (Bildgebung begann 4 Stunden nach der Mtz-Exposition). Die Quantifizierung derselben Reaktivitätsparameter wie oben ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen, was zeigt, dass Mtz allein keinen Einfluss auf die Reaktivität von Mikroglia/Makrophagen hat (ergänzende Abbildung 3b). Diese Ergebnisse entsprechen früheren Berichten, in denen festgestellt wurde, dass Mtz allein keinen Einfluss auf die Phagozytenmessungen bei Zebrafischlarven hat40.

Die langfristige therapeutische Anwendung von Dex und anderen Glukokortikoiden ist aufgrund zahlreicher unerwünschter Nebenwirkungen und systemischer Toxizität mit Komplikationen verbunden41. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Konjugation von Dex an Dendrimer-Nanopartikel (im Folgenden D-Dex) Entzündungen in einem Kaninchenmodell für trockenes Auge wirksam unterdrückt und zu einer klinisch relevanten phänotypischen Verbesserung führt32. Darüber hinaus waren D-Dex-Konjugate in der Lage, durch freies Dex induzierte Nebenwirkungen zu reduzieren, vermutlich indem sie Dex gezielt auf reaktive Mikroglia unter entzündlichen Bedingungen abzielten, aber eine effiziente Clearance ohne Entzündung ermöglichten23,30,32. Dementsprechend haben wir getestet, ob D-Dex-Konjugate die Dex-assoziierte systemische Toxizität bei Zebrafischen reduzieren. Zu diesem Zweck haben wir ein PAMAM-Dendrimer der 4. Generation (G4-OH) an Dex konjugiert. Die in dieser Studie verwendeten D-Dex-Konjugate waren zu >98 % rein und enthielten etwa 8 Dex-Moleküle, die an die Oberflächenhydroxylgruppen der PAMAM-Dendrimere konjugiert waren, wie bereits berichtet42. Um zu testen, ob D-Dex die Toxizität bei Zebrafischen verringert, wurden den Larven 5 dpf mit freiem Dex, D-Dex oder Dendrimer allein in das Perikard (PC) injiziert (Injektionen waren erforderlich, da das Einweichen von Fisch in D-Dex keine Hinweise auf Bioaktivität zeigte). ). Insgesamt 504 Larven wurden in einer zweifachen Verdünnungsreihe im Bereich von 2,5 bis 400 μM Dex und D-Dex getestet (Abb. 2a). Die Sterblichkeitsraten für jede Erkrankung wurden bei 7 dpf zwei Tage nach den Injektionen gemessen. Bei niedrigeren Konzentrationen von 2,5 bis 25 μM wurde in keiner der drei Gruppen ein Todesfall beobachtet. Allerdings wiesen mit Dex injizierte Fische bei höheren Konzentrationen eine erhöhte Sterblichkeitsrate auf und erreichten eine Toxizität von 79 % bei 400 μM (LD50 ~207 μM, Abb. 2b). Im Gegensatz dazu wurde in den Gruppen mit Dendrimer- oder D-Dex-Injektionen im Bereich von 50 bis 200 μM keine Toxizität beobachtet, und in der Gruppe mit 400 μM D-Dex-Injektionen wurde nur eine Toxizitätsrate von ~5 % beobachtet (Abb. 2b). Chi-Quadrat-Tests wurden durchgeführt, um die Toxizität jedes Zustands mit der Dendrimer-Kontrolle zu jedem Zeitpunkt zu vergleichen. Für freies Dex wurden statistisch signifikante Anstiege der Toxizität bei 100, 200 und 400 beobachtet (p = 0,0219, 0,0002 bzw. <0,0001). während für D-Dex zu keinem Zeitpunkt Unterschiede in der Toxizität festgestellt wurden. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien überein, in denen D-Dex die Dex-Toxizität abschwächte42.

a Schematische Darstellung eines Injektionstests zum Testen der Dendrimer-, Dex- und D-Dex-Toxizität. Bei 6 dpf wurden Dendrimer, „freies“ Dex oder D-Dex in das Perikard von Zebrafischlarven injiziert (~10 nL injiziertes Volumen, 2,5–400 µM für Dex und D-Dex). Bei 7 dpf wurde die Toxizität anhand der prozentualen Überlebensrate von 24 Fischen pro Zustand in zwei Versuchen quantifiziert. b Liniendiagramm, das die durchschnittliche Toxizität bei 7 dpf für Dendrimer (schwarze Linie), Dex (blaue Linie) und D-Dex (orange Linie) anzeigt. Vergleiche zwischen Dex- oder D-Dex- und Dendrimer-Monokontrollen zeigten statistisch signifikante Anstiege der Toxizität nur für Dex-injizierte Larven (100–400 μM, *p ≤ 0,05, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001). ).

Um die Dendrimer-Clearance-Raten ohne Zellverlust direkt zu beurteilen, untersuchten wir die Pharmakokinetik fluoreszierend markierter Dendrimer-Partikel mithilfe der longitudinalen In-vivo-Bildgebung des gesamten Organismus. FITC-markierte Dendrimere (D-FITC) wurden in den PC von 5 dpf Zebrafischen injiziert. Anschließend wurden die Fische 1 und 2 Tage nach der Injektion (dpi) mittels intravitaler konfokaler Mikroskopie abgebildet. Bei 1 dpi hatte sich D-FITC in der Niere angesammelt (ergänzende Abbildung 4a). Zur Beurteilung der D-FITC-Clearance wurde Imaris verwendet, um das D-FITC-Fluoreszenzsignal in der Zebrafischniere (roter Kreis) bei 1 und 2 dpi pro Larve zu quantifizieren. Im Durchschnitt gingen 27 % des D-FITC-Signals zwischen 1 und 2 dpi verloren, was die Clearance injizierter Dendrimere in Zebrafischlarven ohne Zellablation und begleitende Mikroglia-Reaktivität zeigt (ergänzende Abbildung 4b).

Frühere statische Bildgebungsstudien haben gezeigt, dass sich Dendrimer-Nanopartikel in reaktiven Mikroglia/Makrophagen an Stellen mit Verletzungen/Entzündungen ansammeln27,32. Der Zeitpunkt und die Spezifität des Dendrimer-Immunzell-Targetings im Verhältnis zum Beginn der Verletzung sind nach wie vor weniger klar definiert. Um die Dynamik des Dendrimer-Targetings besser beurteilen zu können, wurde eine konfokale In-vivo-Zeitrafferbildgebung von Cy5-konjugierten Dendrimeren (D-Cy5; Abb. 3a)42 an mit ± Mtz behandelten NTR-YFP-Larven durchgeführt. Um Wechselwirkungen zwischen Cy5-markierten Dendrimeren, sterbenden Stäbchenzellen und Immunzellen zu überwachen, wurden NTR-YFP-Fische mit einer anderen transgenen Linie kombiniert, die tdTomato in Makrophagen/Mikroglia exprimiert, Tg(mpeg1.1:LOX2272-LOXP-tdTomato-LOX2272-Cerulean- LOXP-EYFP)w201. Um ein anhaltendes Entzündungsumfeld zu fördern, wurde die Zellablation verlängert, indem die Larven 48 Stunden lang mit einer verringerten Mtz-Konzentration (2,5 mM) von 5–7 dpf behandelt wurden. In der Mitte dieses Prozesses wurde D-Cy5 bei 6 dpf perikardial injiziert und die Zeitrafferbildgebung begann ca. 30 Minuten danach (Abb. 3b). Zeitraffersequenzen von +Mtz-Larven zeigen häufig Hinweise auf Mikroglia-Targeting, wobei D-Cy5-Partikel in stark wandernden Zellen beobachtet werden (Zusatzfilm 6). Vergrößerte Ausschnitte aus Standbildern einer repräsentativen +Mtz-Larve zeigen Beispiele von D-Cy5-Partikeln in retinalen Mikroglia (Abb. 3c). Gelegentlich beobachteten wir bei nicht ablatierten Kontrolllarven auch nicht wandernde Mikroglia/Makrophagen, die D-Cy5 verschlungen hatten (Abb. 3d). Die automatisierte IMARIS-basierte Quantifizierung ergab jedoch einen signifikanten Anstieg kolokalisierter Pixel zwischen D-Cy5 und Mikroglia in Mtz-behandelten Larven im Vergleich zu nicht-ablatierten Kontrollen, was darauf hindeutet, dass die Ablation von Stäbchenzellen zu verstärkten Wechselwirkungen zwischen Dendrimeren und Mikroglia führte (p = 0,0428; Abb . 3e). Das Dendrimer-verstärkte Targeting reaktiver Phagozyten steht somit im Gegensatz zu Nanopartikeln wie Siliziumdioxid, die während einer Entzündung eine verringerte Makrophagenaufnahme zeigen43. Schließlich beobachteten wir Fälle sowohl innerhalb als auch außerhalb der Netzhaut, in denen D-Cy5-Punkte nicht mit transgenen Mikroglia/Makrophagen kolokalisiert waren. Diese Signale deuten auf eine D-Cy5-Assoziation mit anderen Zelltypen wie sterbenden Stäbchen, RPE, MG oder extrazellulärem D-Cy5 hin, die noch nicht aufgenommen wurde. Wir stellen fest, dass in früheren Berichten eine Dendrimeraufnahme durch RPE-Zellen beobachtet wurde25, was darauf hindeutet, dass dies die Quelle dieses Signals sein könnte25.

ein Verfahren zur Konjugation von Cy5 an PAMAM G4-OH-Dendrimere (D-Cy5) unter Verwendung von Cy5 NHS und Boratpuffer. b Schematische Darstellung des Assays: Transgene Zebrafische, die NTR:Stäbchen (gelb) und Mikroglia/Makrophagen (rot) exprimieren, wurden mit 2,5 mM Mtz aus 5–7 dpf behandelt, um den Verlust von Stäbchenzellen zu induzieren. Bei 6 dpf wurden den Fischen PC-Injektionen von D-Cy-5 (Cyan, 2 ng/ul) verabreicht und sie wurden mittels konfokaler Zeitreihenmikroskopie in vivo abgebildet. c Standbilder einer repräsentativen Larve bei 0, 2 und 4 hpi mit allen drei Kanälen (obere Felder) oder mit entferntem gelben Kanal (untere Felder); Einschübe und orangefarbene Kreise verdeutlichen die Wechselwirkungen zwischen Dendrimeren (Cyan) und Mikroglia (Rot). Die Zeitraffersequenz finden Sie im Ergänzungsfilm 6. d Drei- (links) und Zweikanalbilder (rechts) Standbilder der nicht-ablatierten Kontrolllarve bei 2 hpi von D-Cy5; Orangefarbene Kreise markieren Wechselwirkungen zwischen Dendrimeren (Cyan) und Mikroglia (Rot). e Imaris-basierte Quantifizierung der normalisierten Kolokalisierung zwischen Mikroglia- (rot) und D-Cy5-Signalen (Cyan) in behandelten Netzhäuten ±Mtz (n = 4 Larven pro Bedingung), +Mtz-Werte wurden auf abgebildete gepaarte Geschwister-Kontrollfische (−Mtz) normalisiert am selben Tag (*p ≤ 0,05).

Wir haben zuvor einen Anstieg der Regenerationskinetik von Stäbchen-Photorezeptoren um etwa 30 % beobachtet, wenn Fische 24 Stunden nach der Induktion der Stäbchenzellablation mit freiem Dex behandelt wurden16. Hier verwendeten wir dasselbe Paradigma der Immunsuppression nach der Ablation, um die Auswirkungen von freiem Dex, D-Dex und unkonjugierten Dendrimeren auf die Regenerationskinetik von Stäbchenzellen zu vergleichen (Abb. 4a). NTR-Stäbchenlarven wurden 24 Stunden lang 10 mM Mtz bei 5–6 dpf ausgesetzt, um die Ablation von Stäbchenzellen zu induzieren. Mtz wurde dann entfernt und die Larven wurden entweder: (1) in normale Bedingungen zurückgebracht, „+Mtz“-Kontrollen; (2) eingetaucht in freies Dex, „+Mtz, +Dex (einweichen, 2,5 μM)“, Kontrolle für verbesserte Regeneration, gemäß unserer vorherigen Studie16; oder injiziert mit entweder (3) 5 μM Dex, „+Mtz, +Dex (inj)“, (4) 5 μM D-Dex, „+Mtz, +D-Dex (inj)“ oder (5) nicht- konjugierte Dendrimere, „+Mtz, +Dendrimer (inj)“. Bei 9 dpf (4 Tage nach der Ablation, dpa). Die Regenerationskinetik von YFP+-Stäbchenzellen wurde mit einem etablierten Fluoreszenzplatten-Reader-Assay gemessen44. Im Vergleich zu reinen Mtz-Kontrollen tendierten alle drei mit Dex behandelten Zustände zu einer verstärkten Stäbchenzellregeneration, während die Dendrimer-injizierte Gruppe keinen Einfluss auf die Regenerationskinetik zeigte (Abb. 4b). Statistisch signifikante Steigerungen wurden für die Bedingungen +Dex (Einweichen) und +D-Dex (Injektion) beobachtet. Der mit freiem Dex beobachtete Anstieg der Regenerationskinetik betrug ~33 % (Abb. 4b, *p = 0,0459), was mit unseren früheren Erkenntnissen übereinstimmt16. Interessanterweise zeigten mit D-Dex injizierte Larven eine Verbesserung der Regenerationskinetik von Stäbchenzellen um ~ 67 % (Abb. 4b, ****p = 1,6E-05); eine statistisch signifikante Verdoppelung der beim Eintauchen in freien Dex beobachteten Steigerung der Regenerationsrate (Abb. 4b, **p = 0,0023). Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Dendrimer-basierte Ausrichtung von Dex auf reaktive Mikroglia die regenerationsfördernde Wirkung der Dex-Behandlung nach der Ablation weiter verstärkte.

a Assay-Schema für Daten in (b): 5 dpf NTR-Stäbchenlarven wurden 24 Stunden lang 10 mM Mtz ausgesetzt und dann in 5 Gruppen aufgeteilt, (1) „+Mtz“; (2) 2,5 μM freiem Dex aus 6–9 dpf ausgesetzt, „+Mtz, +Dex (einweichen)“; oder bei 6 dpf mit entweder (3) 5 μM freiem Dex, „+Mtz, +Dex (inj)“ injiziert; (4) 5 μM D-Dex, „+Mtz, +D-Dex (inj)“ oder (5) Dendrimere allein, „+Mtz, +Dendrimer (inj)“. Bei 9 dpf (4 dpa) wurde das NTR-YFP-Stabsignal durch einen Plattenlesetest quantifiziert. b Quantifizierung der NTR-YFP-Signale bei 9 dpf (4 dpa) zur Beurteilung der Regenerationskinetik von Stäbchenzellen, n = 77, 58, 60, 44 und 28 Larven von links nach rechts (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ****p ≤ 0,0001). c Repräsentative Abschnitte von 8 dpf-Larven, die entweder mit 10 mM Mtz nur bei 5–6 dpf, D-Dex-Injektion nur bei 6 dpf oder Mtz (5–6 dpf) gefolgt von D-Dex-Injektion bei 6 dpf behandelt wurden. Die Bilder zeigen NTR:Stäbchenzellen (gelb), DAPI (blau, Kerne) und Immunfärbung für PCNA (rot, proliferierende Zellen). d Quantifizierung von PCNA+-Zellen (ohne Berücksichtigung der CMZ-Region), n = 8, 9 und 10 von links nach rechts. e Repräsentative Abschnitte von 10 dpf-Larven, die entweder mit 10 mM Mtz nur von 5–6 dpf oder mit Mtz, gefolgt von einer D-Dex-Injektion bei 6 dpf, behandelt wurden. Die Bilder zeigen NTR:Stäbchenzellen (gelb), DAPI (blau, Kerne) und Immunfärbung für BrdU (rot, proliferierende Zellen). f Quantifizierung von NTR-YFP-exprimierenden Stäbchenzellen, n = 14 für jede Gruppe. g Quantifizierung von BrdU+-Zellen, n = 14 für jede Gruppe (*p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ****p ≤ 0,0001, alle anderen zeigten statistisch nicht signifikante Unterschiede).

Um Mechanismen zu untersuchen, durch die D-Dex die Regeneration von Stäbchenzellen weiter steigerte, verglichen wir die Proliferationsraten in der Netzhaut von YFP-NTR-Larven, die ± Mtz und mit oder ohne D-Dex-Injektion nach der Ablation behandelt wurden. Auf 24-stündige Mtz-Expositionen von 5 bis 6 dpf folgten perikardiale D-Dex-Injektionen wie oben. Anschließend wurden die Larven bei 8 dpf gesammelt und für die DAPI-Färbung verarbeitet und mit einem Antikörper gegen proliferatives Zellkernantigen (PCNA) immunmarkiert. Mit Mtz allein behandelte Larven zeigten einen Verlust an YFP-exprimierenden Stäbchenzellen und zeigten leichte PCNA-Markierung (Abb. 4c, oberes Feld). Nicht-ablatierte Kontrollen, denen D-Dex mit 6 dpf injiziert wurde, zeigten eine Aufrechterhaltung der YFP-exprimierenden Stäbchenzellen und ähnliche Niveaus der PCNA-Markierung (Abb. 4c, mittleres Feld). Mit Mtz behandelte Larven, denen D-Dex injiziert wurde, zeigten einen deutlichen Anstieg der Anzahl PCNA-exprimierender Zellen und Hinweise auf eine vorzeitige Regeneration von Stäbchenzellen (Abb. 4c, unteres Feld). Die Quantifizierung der durchschnittlichen Anzahl von PCNA+-Zellen pro Netzhaut zeigte einen signifikanten Anstieg des Mtz + D-Dex-Zustands im Vergleich zu Mtz allein und nur D-Dex-Fischen (p = 2,05E-02 bzw. p = 4,1E-03; Abb . 4d).

Um anschließend die Auswirkungen von D-Dex auf die Proliferation später in der Regeneration zu untersuchen, wurden die Larven mit Mtz ablatiert und dann mit 6 dpf entweder Thymin-analoges Bromdeoxyuridin (BrdU, 10 mM) allein oder BrdU + D-Dex (5) injiziert μM). Allen Larven wurde erneut BrdU mit 7 und 8 dpf injiziert, um eine robuste Markierung proliferierender Zellen sicherzustellen. Die Larven wurden bei 10 dpf zur Immunfärbung mit DAPI und Anti-BrdU gesammelt. Wie erwartet war bei beiden Bedingungen eine deutliche BrdU-Färbung in der Ziliarrandzone (CMZ) vorhanden, die als Kontrolle für die Markierung proliferativer Marker dient. Allerdings zeigten Netzhäute aus der Mtz +D-Dex-Gruppe eine Zunahme markierter Zellen in der inneren und äußeren Kernschicht, wo sich Müller-Glia (MG)-Stammzellen und/oder MG-abgeleitete Vorläuferzellen während der Netzhautregeneration befinden (Abb. 4e). Die Quantifizierung der durchschnittlichen Anzahl YFP-NTR-exprimierender Stäbchenzellen zeigte einen signifikanten Anstieg in der Mtz + D-Dex-Gruppe im Vergleich zu Mtz allein (Abb. 4f, p = 2,4E-02). In ähnlicher Weise war auch die Anzahl der BrdU-exprimierenden Zellen in der Netzhaut (ohne Linse und CMZ) in der Mtz + D-Dex-Gruppe erhöht (Abb. 4g, p = 5,3E-03).

Um den Mechanismus zu untersuchen, durch den D-Dex die Regenerationskinetik von Stäbchenzellen weiter steigerte, führten wir eine Massen-RNA-Seq durch, um zu vergleichen: (1) unbehandelte Kontrollen, (2) „+Mtz“ (10 mM von 5–6 dpf), (3 ) „+Mtz, +D-Dex“ (5 μM bei 6 dpf) und (4) „+D-Dex“ (5 μM bei 6 dpf). Die Augen wurden 24 Stunden nach der Injektion von D-Dex bei 7 dpf gesammelt, um frühe differentiell exprimierte Gene (DEGs) zu identifizieren, die mit Mtz-Exposition und/oder D-Dex-Injektionen assoziiert sind (Abb. 5a). Nach der Sequenzierung wurden die Rohdaten auf Qualität überprüft und mit dem Zebrafisch-Referenzgenom abgeglichen. Das Bioconductor-Paket „edgeR“ wurde verwendet, um DEGs zwischen Bedingungen zu identifizieren (d. h. Gene mit einer Falscherkennungsrate (FDR) von <0,10 und einer log2-fachen Änderung von mindestens ±1). Eine Teilmenge der Top-DEGs wird über alle Bedingungen hinweg zusammen mit einem Dendrogramm aufgetragen, um die Konsistenz der Genexpressionsänderungen über biologische Replikate hinweg anzuzeigen (Abb. 5b).

ein Assay-Schema für RNA-seq-Assays. Augen von NTR:Stäbchenlarven unter vier Bedingungen (unbehandelt, nur Mtz, +Mtz, +D-Dex oder nur D-Dex) wurden 24 Stunden nach D-Dex-Injektionen (sofern zutreffend) bei 7 dpf gesammelt und auf RNA verarbeitet Sequenzierung. b Teilmenge der statistisch signifikantesten DEGs unter allen Bedingungen (Rot zeigt Hochregulierung an, Blau zeigt Herunterregulierung an). c Anzahl der hoch- und herunterregulierten DEGs, die ausgewählten GO-Begriffen zugeordnet sind. Die Fischsymbole in Tafel (a) wurden mit Genehmigung von Biorender erstellt.

Um Gene zu identifizieren, die D-Dex mit einer verbesserten Stäbchenregeneration verbinden, haben wir uns auf die folgenden Vergleiche konzentriert: (1) nur Mtz vs. unbehandelt, (2) nur Mtz vs. +Mtz, +D-Dex und (3) + D- Nur Dex im Vergleich zu +Mtz, +D-Dex, was jeweils 168, 86 und 277 Grad ergibt (siehe Ergänzende Daten 1 für eine vollständige Liste der Grad). Dies ermöglichte es uns, DEGs/Pfade zu identifizieren, die mit der D-Dex-Exposition im Zusammenhang mit nicht-ablatierten und ablatierten Netzhäuten korrelieren. Eine Analyse der funktionellen Anreicherung zwischen nur Mtz und unbehandelten Kontrollen ergab hochregulierte DEGs für Begriffe der Genontologie (GO) im Zusammenhang mit Apoptose und akuten Entzündungsreaktionen sowie eine Herunterregulierung von DEGs im Zusammenhang mit der Reaktion auf Lichtreize und Augenentwicklung (Abb. 5c, obere Reihe). Vergleiche von +Mtz, +D-Dex mit reinen Mtz-Netzhäuten ergaben hochregulierte DEGs für GO-Begriffe im Zusammenhang mit Stammzellproliferation, Netzhautentwicklung, Chromatin-vermittelter Aufrechterhaltung der Transkription und Herunterregulierung der MAPK-Signalübertragung (Abb. 5c, mittlere Reihe). Vergleiche zwischen +Mtz-, +D-Dex- und D-Dex-only-Kontrollen ergaben hochregulierte DEGs für die GO-Begriffe NF-kB-Signalisierung und Erzeugung von Neuronen sowie herunterregulierte DEGs für allgemeine immunbezogene Prozesse. Diese Ergebnisse stimmen mit der Verbesserung der Regenerationskinetik durch D-Dex überein, indem es die Auflösung der Immunzellreaktivität beschleunigt (Abb. 5c, untere Reihe). Wir haben auch mehrere immunbezogene Faktoren, die zuvor an der Regeneration der Netzhaut beteiligt waren, mithilfe von qRT-PCR direkt bewertet, um auf D-Dex-assoziierte Veränderungen zu testen. Die Ergebnisse zeigten eine Hochregulierung von il6st und stat3, eine Herunterregulierung von TNF-alpha und keine Veränderung der mmp9-Expression (ergänzende Abbildung 5).

Um eine Untergruppe von DEGs, die an der D-Dex-verstärkten Regenerationskinetik von Stäbchenzellen beteiligt sind, funktionell zu testen, wurde eine schnelle CRISPR/Cas9-basierte Knockdown-Screening-Methode47 verwendet. Vier der am besten hochregulierten DEGs (Mtz+D-Dex vs. Mtz allein, durchschnittliche Faltungsänderung von 8,16) wurden ausgewählt: rnf2, kcnj13, col11a2 und nosip (Abb. 6a). Die Suche in einer Online-Expressionsdatenbank (ZFIN) nach bekannten Expressionsmustern ergab eine bekannte Expression von rnf2 und kcnj13 im Auge sowie eine bekannte Rolle bei der Funktion des Immunsystems. Für col11a2 und nosip waren weniger Informationen verfügbar; Darüber hinaus führte der Ausfall dieser beiden zu Entwicklungsstörungen, die weitere Tests ausschlossen. Um die Funktion von rnf2 und kcnj13 zu beurteilen, verwendeten wir zunächst qRT-PCR, um die Hochregulierung in ablatierten Larven zu bestätigen, denen D-Dex injiziert wurde (Abb. 6b). Um die Rolle bei der Regeneration von Stäbchenzellen zu testen, wurden „knusprige“ F0-Larven geschaffen, d. Crispant- und Kontrolllarven wurden einer Stäbchenzellablation bei 5 dpf (10 mM Mtz, 24 h) unterzogen und erhielten dann eine perikardiale Injektion von D-Dex bei 6 dpf (5 μM). Die Regeneration der Stäbchenzellen wurde wie oben mit 9 dpf bewertet. Der Effekt des kcnj13-Knockdowns war minimal, was darauf hindeutet, dass es keine spezifische Rolle bei der Regeneration von Stäbchenzellen spielt (Abb. 6d). Im Gegensatz dazu zeigten rnf2-Knockdown-Larven bei 9 dpf eine deutlich verringerte Stäbchenregeneration im Vergleich zu +Mtz, +D-Dex-Kontrollen (Abb. 6c, d, p = 3.45E-02). Diese Daten zeigen, dass rnf2 für die durch D-Dex ermöglichte Beschleunigung der Regenerationskinetik von Stäbchenzellen erforderlich ist.

ein Volcano-Plot von DEGs zwischen nur Mtz und +Mtz, +D-Dex behandelten Augen. Rot zeigt eine statistisch signifikante Hochregulierung an und Blau zeigt eine statistisch signifikante Herunterregulierung an. b qRT-PCR-Bewertung der Hochregulierung von rnf2 und kcnj13 im Zustand +Mtz, +D-Dex. c Quantifizierung von NTR-YFP-exprimierenden Stäbchenzellen bei 9 dpf zur Beurteilung von Veränderungen in der Regenerationskinetik in +Mtz-, +D-Dex-Larven nach dem Abbau von rnf2 und kcnj13, n = 54, 22, 24 und 7 von links nach rechts ( *p ≤ 0,05). d Repräsentative konfokale In-vivo-Bilder von NTR-Stäbchen-Larvennetzhäuten bei 9 dpf nach +Mtz-, +D-Dex-Behandlungen entweder auf Wildtyp-Kontroll- (links) oder auf rnf2-Knockdown-„knackigen“ Hintergründen. Stichprobengrößen von links nach rechts: 54, 21, 14 und 7.

Unsere frühere Studie legte nahe, dass Mikroglia bei der Netzhautregeneration in Zebrafischlarven eine zweiphasige Rolle spielen – eine anfängliche Reaktivität ist erforderlich, um den Regenerationsprozess zu stimulieren, während die anschließende Immunsuppression nach der Verletzung zu einer beschleunigten Regenerationskinetik führt16. Aktuelle Studien haben bestätigt, dass anfängliche Entzündungsreaktionen48 die Regeneration der Netzhaut fördern18,49,50; Die zellulären und molekularen Mechanismen, die den pro-regenerativen Wirkungen der Immunsuppression nach einer Verletzung zugrunde liegen, sind jedoch weiterhin ungeklärt. Durch die Kombination von In-vivo-Zeitrafferbildgebung und Immunhistologie zur Untersuchung zellulärer Reaktionen fanden wir Hinweise darauf, dass Dex nach der Verletzung die Mikroglia-Reaktivität hemmte und/oder die Mikroglia-Auflösung beschleunigte und die Proliferation von mutmaßlichem MG und MG-abgeleiteten Vorläufern erhöhte, die der Konjugation an Dendrimer-Nanopartikel dienten um Dex auf reaktive Mikroglia (und möglicherweise andere Phagozyten wie RPE) auszurichten, verringerte die systemische Toxizität und verbesserte die proregenerative Wirkung der Immunsuppression nach einer Verletzung. In Kombination mit den jüngsten Erkenntnissen, dass: (1) Makrophagen/Mikroglia an mehreren regenerativen Paradigmen in der Netzhaut des Zebrafischs beteiligt sind45,48,49,51,52, (2) die selektive Ablation von Stäbchenzellen nicht zur Invasion peripherer Makrophagen führt16 und ( 3) Da Glukokortikoide wie Dex etablierte Immunsuppressiva sind53, interpretieren wir die verstärkten regenerativen Wirkungen von Dendrimer-Dex-Konjugaten wahrscheinlich als Ergebnis der verbesserten Auflösung der Mikroglia-Reaktivität. Angesichts der Tatsache, dass MG in anderen Arten als Fischen nachweislich den Glukokortikoidrezeptor exprimiert15 und dass Glukokortikoide nachweislich Auswirkungen auf retinale Stammzellen haben15,54, können wir eine zusätzliche Rolle für die Wirkung von Dex oder Dendrimer-Dex auf retinale Stammzellen nicht ausschließen MG-Zellen direkt. Schließlich identifizierten Transkriptomanalysen und Funktionstests ein Gen, rnf2, das für die proregenerative Wirkung der Immunsuppression nach einer Verletzung erforderlich ist. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit aktuellen Berichten, die zeigen, dass Mikroglia/Makrophagen kontextabhängige18,49,50 und/oder artspezifische Rollen während der Netzhautregeneration spielen10,17, was darauf hindeutet, dass die Modulation des Immunsystems eine wichtige Komponente bei der therapeutischen Förderung der neuronalen Regeneration sein wird.

Durch die Berücksichtigung der hochdynamischen Natur zellulärer Verhaltensweisen und Zell-Zell-Interaktionen in vivo hat die intravitale Bildgebung wichtige Einblicke in Entwicklungs- und Regenerationsprozesse ermöglicht55,56. In unserer vorherigen Studie konnten wir mithilfe der In-vivo-Zeitrafferbildgebung Mikroglia von peripheren Makrophagenreaktionen auf Netzhautzellverlust abgrenzen und so eine wesentliche Einschränkung des Feldes überwinden16. Hier ermöglichte AO-LLSM eine verbesserte räumlich-zeitliche Auflösung der Mikroglia-Dynamik während der Netzhautregeneration. Die Daten zeigten, dass Dex-Behandlungen nach der Ablation die Migrationsgeschwindigkeit der Mikroglia verringerten, was auf eine Hemmung der Reaktivität schließen lässt. Darüber hinaus stellten wir fest, dass Mikroglia in der Nähe des anhaltenden Verlusts von Stäbchenzellen heterogene Reaktionen zeigten (Supp Movie 3). Eine Untergruppe blieb während des gesamten Bildgebungszeitraums in direktem Kontakt mit sterbenden Stäbchenzellen, während andere Zellen ein stark bewegliches oder nicht reaktives homöostatisches Verhalten zeigten. Diese Daten stehen im Einklang mit Hinweisen auf funktionell abgrenzbare Mikroglia-Subtypen, die durch heterogene transkriptomische Einzelzellstudien48,57 nahegelegt und kürzlich in Mausmodellen der Netzhautdegeneration58, im Gehirn59 und Rückenmark60 des Zebrafisches sowie während der Muskelregeneration beim Zebrafisch55 bestätigt wurden. Die Parallelen zwischen unseren Daten und der letztgenannten Studie sind besonders faszinierend, da Ratnayake et al. zeigten, dass „wohnende“ Makrophagen – also diejenigen, die mit der Verletzungsstelle verbunden bleiben – Faktoren absonderten, die die Stammzellproliferation fördern. Weitere Studien sind erforderlich, um die Funktionen des Mikroglia-Subtyps während der Regeneration der Netzhaut zu definieren, einschließlich der Rolle bei der Stimulierung der MG-Proliferation.

Klinische Studien zur systemischen Glukokortikoid-Immunsuppression als Strategie zur Linderung neurodegenerativer Erkrankungen sind gescheitert20. Gezielte Verabreichungsansätze wie PAMAM-Dendrimer22,23,31,61 könnten verwendet werden, um unerwünschte systemische Wirkungen zu reduzieren und so die Vorteile dieser wirksamen Medikamentenfamilie bei ZNS-Erkrankungen zu nutzen. Wir verwendeten Dendrimere, um die Auswirkungen einer gezielten Abgabe von Dex an reaktive Mikroglia auf die Netzhautregeneration zu testen. Die Ergebnisse zeigten, dass D-Dex-Formulierungen die Dex-assoziierte Toxizität reduzierten, die Bekämpfung reaktiver Makrophagen erleichterten und die proregenerative Wirkung von Dex-Behandlungen nach Verletzungen verbesserten. Diese Ergebnisse und verwandte Studien, die zeigen, dass Immunsuppression die Regenerationsfähigkeit der Netzhaut von Mäusen verbessert17, legen nahe, dass eine gezielte Modulation der Immunzellreaktionen auf den neuronalen Zelltod eine verallgemeinerbare Strategie zur Steigerung der Aktivität neuronaler Stammzellen darstellen könnte. Zusätzliche Studien werden erforderlich sein, um zu bestimmen, wie eine beschleunigte Regenerationskinetik der Netzhautzellen mit der Wiederherstellung von Sehdefiziten zusammenhängt – wenn die Wirkung von Dex ausschließlich durch eine Modifikation der Mikroglia-Reaktivität vermittelt wird – und die Auswirkungen einer gezielten Immunmodulation in Netzhautregenerationsmodellen von Säugetieren.

Um molekulare Mechanismen zu untersuchen, verwendeten wir Massen-RNA-seq und qRT-PCR, um Genexpressionsänderungen im Zusammenhang mit der D-Dex-verstärkten Netzhautregeneration und schnellen CRISPR/Cas9-ermöglichenden Knockdown-Methoden zum Testen der Genfunktion zu bewerten. D-Dex war mit Gennetzwerken verbunden, die an der dynamischen Regulierung der Chromatinregulation sowie der MAPK- und NF-kB-Signalübertragung beteiligt sind, alles Signalwege, von denen bekannt ist, dass sie die MG-Reaktionen auf Verletzungen bei Zebrafischen verändern. MAPK- und NF-kB-Signalwege werden beim Zelltod in der Netzhaut aktiviert, was zu einer proinflammatorischen Zytokinkaskade führt, die auf hochregulierende proregenerative Gene wie stat345,62,63 trifft – unsere qRT-PCR zeigte, dass es sich bei den inflammatorischen Zytokinfaktoren il6st und stat3 handelte auch durch D-Dex hochreguliert. Wir identifizierten kcnj13 und rnf2 als durch D-Dex stark hochreguliert und zeigten, dass rnf2, jedoch nicht kcnj13, für die verbesserte proregenerative Wirkung von D-Dex erforderlich war. Als Schlüsselkomponente des Polycomb-Repressorkomplexes 1 (PRC1)64 fungiert rnf2 als E3-Ubiquitin-Ligase. Da gezeigt wurde, dass rnf2 den Kernaktivierungskomplex von Notch65 bindet und vermutlich als Repressor der Notch-Signalisierung fungiert, könnte eine Hochregulierung von rnf2 durch D-Dex dazu dienen, die Unterdrückung von Notch zu verstärken. Da gezeigt wurde, dass die Notch-Hemmung die Regeneration der Netzhaut fördert66,67, kann der Abbau von rnf2 die D-Dex-vermittelte Unterdrückung von Notch stören. Wie in einer aktuellen Übersicht ausführlich dargelegt, ist eine weitere Untersuchung der Faktoren erforderlich, die sich auf die Notch-Signalübertragung während der Netzhautregeneration auswirken, um mögliche kontextspezifische Rollen zu klären68.

Insgesamt tragen unsere Ergebnisse zu einer wachsenden Wertschätzung der Bedeutung und kontextabhängigen Natur neuroimmuner Interaktionen bei und unterstreichen die Notwendigkeit umfassender Untersuchungen der Funktion des Mikroglia-Subtyps während der neuronalen Degeneration und Regeneration sowie den potenziellen Wert nanopartikelbasierter Strategien für das Targeting reaktive Immunzellen. Basierend auf diesen und verwandten Erkenntnissen gehen wir davon aus, dass die Erlangung der Kontrolle über Mikroglia-Reaktionen auf den Verlust neuronaler Zellen eine therapeutische Strategie zur Förderung der Nervenreparatur beim Menschen darstellen könnte.

Alle Studien wurden gemäß den Empfehlungen des Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) für Zebrafischstudien und einem genehmigten Tierprotokoll des Johns Hopkins University Animal Care and Use Committee durchgeführt. Alle Fische wurden unter etablierten Bedingungen bei 28,5 °C und einem Licht-Dunkel-Zyklus von 14:10 Stunden gehalten. Zu den hier verwendeten zuvor veröffentlichten transgenen Linien gehörten: Tg(rho:YFP Eco. NfsB)gmc50035, Tg(mfap4.1:Tomato-CAAX)xt669 und Tg(mpeg1.1:LOX2272-LOXP-tdTomato-LOX2272-Cerulean-LOXP- EYFP)w20170. Tg(rho:YFP Eco. NfsB)gmc500 exprimiert ein bakterielles Nitroreduktase (NTR)-Enzym selektiv in Stäbchenzellen, um eine selektive Ablation zu ermöglichen (siehe unten). Diese Linie wurde in einer Pigmentierungsmutante, roya9 (roy), weiter vermehrt, um den Nachweis des YFP-Signals in vivo zu erleichtern.

NTR:YFP-exprimierende Larven wurden bei 5 dpf in gleich große Gruppen aufgeteilt: (i) unbehandelte Kontrollen und (ii) Larven, die entweder 24 Stunden lang mit 10 mM Metronidazol (Mtz, Acros) oder 48 Stunden lang mit 2,5 mM Mtz bei 5 behandelt wurden dpf (speziell zur Verlangsamung des Verletzungsprozesses für die konfokale In-vivo-Bildgebung). Mtz wird durch NTR zu einer zytotoxischen Substanz reduziert, was zu DNA-Schäden und anschließendem spezifischen Zelltod führt. Nach der Mtz-Behandlung wurden die Fische gespült und in ~0,3 Å Danieaus Lösung gehalten, bis sie quantifiziert, abgebildet oder getötet wurden. Für Experimente mit nicht-konjugierter Dex-Behandlung wurden gleich große Gruppen von mit Mtz abgetragenen Fischen mit 2,5 μM freiem Dex behandelt. Zur Kontrolle wurden zusätzlich nur mit Dex behandelte Fische sowie unbehandelte Fische verwendet.

Die TUNEL-Färbung wurde 24 Stunden nach Beginn von Mtz bei 5 dpf unter Verwendung des TMR-Rot-In-Situ-Zelltoderkennungskits (Sigma-Aldrich) durchgeführt. Nach der histologischen Vorbereitung und dem Schneiden mit einer zuvor veröffentlichten Methode16 wurden die Objektträger mit PBS, das 1 % Natriumcitrat/1 % TritonX-100 enthielt, bei 4 °C behandelt, mit PBS gespült und dann 30 Minuten lang bei 37 °C mit dem TUNEL-Reaktionscocktail inkubiert C. Anschließend wurden für jeden Objektträger unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops und unter Verwendung etablierter Protokolle konfokale Z-Stapel-Bilder aufgenommen71. TUNEL+-Zellen wurden dann über 10 nichtablatierte und +Mtz-Kontrollnetzhäute gezählt.

Etwa 5–7 dpf Zebrafische wurden mit Tricain (0,16 mg/ml) anästhesiert und dann in einen 0,8 %igen Agarosetropfen mit niedrigem Schmelzpunkt auf einem 25-mm-Deckglas eingebettet. Zur Positionierung und Ausrichtung der Fische wurde eine selbstgemachte Haarschlaufe verwendet. Die Anregungs- und Detektionsobjektive wurden zusammen mit dem 25-mm-Deckglas in ~40 ml E3-Medium + PTU bei Raumtemperatur (22 ± 1 °C) eingetaucht. Zebrafische, die Tg(rho:YFP Eco. NfsB)gmc500 und Tg(mfap4.1:Tomato-CAAX)xt6 exprimieren, um Stäbchen-Photorezeptoren bzw. Mikroglia/Makrophagen zu markieren16, wurden gleichzeitig mit 514-nm- und 560-nm-Lasern angeregt (514-nm-Betrieb bei ~3 mW und 560 nm bei 5 mW, entsprechend ~15 und ~25 μW an der hinteren Apertur des Anregungsobjektivs) mit einer Belichtungszeit von 20–50 ms. Es wurden Dithering-Gitter-Lichtblattmuster mit einer inneren/äußeren numerischen Apertur von 0,36/0,4 für beide Farben verwendet. Die optischen Schnitte wurden durch Scannen des Probentisches mit einer Schrittweite von 400–500 nm gesammelt, was einer axialen Schrittweite von 200–250 nm in der Detektionszielkoordinate entspricht, mit insgesamt 121–201 Schritten. Die Emissionen der beiden Fluorophore wurden durch einen Langpassfilter (Di03-R561-t3, Semrock) getrennt und von zwei Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 sCMOS-Kameras (Hamamatsu Photonics) erfasst. Vor der Erfassung der Zeitreihendaten bestehend aus 100–200 Zeitpunkten wurde das abgebildete Volumen mithilfe einer auf einem Zwei-Photonen-„Leitstern“ basierenden adaptiven Optikmethode auf optische Aberrationen korrigiert (Manuskript in Vorbereitung). Jedes abgebildete Volumen wurde mit experimentell gemessenen Punktspreizfunktionen, die aus 100-nm-Tetraspec-Perlen (Thermo Fisher) in C++ unter Verwendung des Richardson-Lucy-Algorithmus auf dem Computercluster des HHMI Janelia Research Campus erhalten wurden, entzerrt und entfaltet. Das AO-LLSM wurde mit der benutzerdefinierten LabVIEW-Software (National Instruments) betrieben.

Um mit AO-LLSM aufgenommene Bilder zu verarbeiten, wurden zunächst entfaltete Dateien nach Fidschi geladen (ImageJ v1.52p; NIH). Jedes Transgen wurde mithilfe eines Fidschi-Makros (.ijm-Datei) auf die entsprechende Farbe eingestellt (Gelb für 514 nm, Cyan für 445 nm und Rot für 560 nm), bevor jeder Kanal in einer Datei zusammengeführt und als TIFF-Datei gespeichert wurde und dann eine.avi-Filmdatei (Komprimierung = JPEG, 7 Bilder pro Sekunde). Als nächstes wurde jede.tiff-Datei, die eine Zeitreihe für jedes Bild umfasst, für das 4D-Rendering in IMARIS (v9.5.1, 9.6.1 und 9.7.0; Bitplane) geladen. Um die Immunzelldynamik zu quantifizieren, wurden 15–19 einzelne Mikroglia (CFP-Kanal) für Gruppen von 5–6 Fischen für jede relevante Erkrankung verarbeitet. Für diese Filme wurden Larven in Abständen von 30–180 s und in einem Volumen von 30 Mikrometern abgebildet. Im CFP-Kanal wurde eine Oberfläche mit identischen Verarbeitungsparametern erstellt, einschließlich Schwellenwerten, um die Fluoreszenzintensität auf ein Niveau einzustellen, das sichtbare Mikroglia richtig markiert. Nach der Verarbeitung wurden automatisch quantifizierte Daten von IMARIS als XLSX-Datei exportiert, in der die Werte für jedes Bild für Migrationsgeschwindigkeit, Sphärizität und Verschiebung gemittelt wurden.

Um den Grad der Kolokalisierung zwischen D-Cy5 und transgenen Mikroglia zu messen, wurde das Kolokalisierungstool IMARIS verwendet, um die Anzahl der kolokalisierten Pixel zwischen dem Bildgebungskanal für Mikroglia und D-Cy5 zu identifizieren. Die Ergebnisse wurden dann auf die nicht abgetragenen Kontrolllarven für jedes Paar der vier analysierten Larvenpaare normalisiert.

Um die Abbildung des Dendrimers in diesem Zebrafischmodell zu ermöglichen, haben wir die hydroxylterminierten PAMAM-Dendrimere der 4. Generation (G4-OH) fluoreszierend markiert, indem wir einen Nah-IR-Farbstoff Cyanin 5 (Cy5) kovalent an die Oberflächen-OH-Gruppen der Dendrimere konjugiert haben, um D zu erhalten -Cy5. Diese Protokolle wurden bereits veröffentlicht72,73. Das D-Cy5-Konjugat wurde mittels Protonen-Kernspinresonanz (1H-NMR) bzw. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf seine Beladung und Reinheit charakterisiert. In ähnlicher Weise wurde für einige Bioverteilungsstudien mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markiertes Dendrimer (D-FITC) verwendet. Die D-FITC-Synthese und -Charakterisierung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Das Dendrimer-Dexamethason-Konjugat (D-Dex) wurde nach einem zuvor beschriebenen Syntheseverfahren synthetisiert42. Kurz gesagt, die D-Dex-Konjugate wurden mithilfe eines zweistufigen Verfahrens synthetisiert. Im ersten Schritt wurde Dexamethason-21-glutarat (Dex-Linker) synthetisiert, indem die -OH-Gruppe an der 21. Position von Dex in Gegenwart von Triethylamin als Base mit dem -COOH der Glutarsäure umgesetzt wurde. Der Dex-Linker wurde mittels Flash-Säulenchromatographie gereinigt. Im zweiten Schritt wurde der Dex-Linker in Gegenwart des Kopplungsmittels Benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinophosphoniumhexafluorphosphat-Diisopropylethylamin (PyBOP) als Base und wasserfreiem Dimethylformamid (DMF) als Lösungsmittel an die -OH-Gruppen auf der Dendrimeroberfläche konjugiert. Das Endprodukt wurde mittels Dialyse gegen DMF gereinigt, um reagierten Dex-Linker und PyBOP-Nebenprodukte für 24 Stunden zu entfernen, gefolgt von einer Dialyse gegen Wasser, um DMF zu entfernen. Das D-Dex-Konjugat wurde mittels 1H-NMR zur Abschätzung der Wirkstoffbeladung und HLPC für seine Reinheit charakterisiert.

Bei allen intravitalen Bildgebungsverfahren wurden zuvor detaillierte Protokolle angewendet71. Fische, die YFP und NTR in Stäbchenphotorezeptoren exprimieren, Tg(rho:YFP Eco. NfsB)gmc500, und tdTomato in Mikroglia/Makrophagen, Tg(mpeg1.1:LOX2272-LOXP-tdTomato-LOX2272-Cerulean-LOXP-EYFP)w201, waren gebraucht. Konfokale Z-Stapel, die die gesamte Augenhöhle oder den gesamten Fisch umfassen (Schrittgröße 5 Mikrometer), wurden in 10- oder 20-Minuten-Intervallen über einen Zeitraum von insgesamt 4,5 bis 20 Stunden gesammelt. Die Bildanalyse wurde mit Fiji (d. h. ImageJ v1.49b; NIH) oder Imaris (v7.6.5; Bitplane) durchgeführt, um durch morphometrische Analyse als Sphärizität, eine Korrelation zwischen Fläche und Volumen oder nach Volumen in der Niere unter Verwendung minimaler Begrenzungskugeln zu quantifizieren. Alle konfokalen In-vivo-Bilder wurden mit einem 20-fach-Objektiv aufgenommen, alle histologischen Bilder mit einem 40-fach-Objektiv.

Bilder der gesamten Netzhaut der Larven wurden wie oben beschrieben unter Verwendung identischer Erfassungs- und IMARIS-Verarbeitungsparameter unter allen Bedingungen erfasst. Das Photorezeptorvolumen wurde mithilfe der lokalen hintergrundbasierten volumetrischen Darstellung von YFP-Signalen von IMARIS berechnet.

Tg(rho:YFP Eco. NfsB)gmc500-Larven wurden mit Mtz ± Dex behandelt und die Regenerationskinetik wurde mit dem ARQiv-System analysiert, wie zuvor in Lit. beschrieben. 16. Ungefähr 5 dpf-Larven wurden 24 Stunden lang 10 mM Mtz ausgesetzt und dann mit einer Einzeldosis von 2,5 μM Free Dex oder mit D-Dex AT 6 dpf behandelt, nachdem der Verlust von YFP-exprimierenden Stäbchenzellen mittels Stereo visuell bestätigt wurde -Fluoreszenzmikroskopie. Bei 7 dpf wurden alle Fische in frisches Medium gegeben, bis der ARQiv-Scan am 9. Tag durchgeführt wurde.

Um sich teilende Zellen mit Antikörpern gegen PCNA bei 8 dpf oder eingebautem BrdU bei 10 dpf zu markieren, wurden YFP-NTR-Larven 24 Stunden lang mit Mtz 5 dpf ablatiert, und die Hälfte erhielt dann eine perikardiale Injektion von D-Dex bei 6 dpf. Nach der Tötung und histologischen Vorbereitung der Schnitte, wie zuvor in Lit. veröffentlicht. 16 wurde der Primärantikörper Anti-PCNA (Maus, Klon PC10, Sigma-Aldrich) oder Anti-BrdU (Maus, Klon BU-33, Sigma-Aldrich) in Verbindung mit dem Sekundärantikörper Alexa Fluor 635 (Molecular Probes) verwendet. Die Objektträger wurden dann als Z-Stapel mit konfokaler Mikroskopie abgebildet und pcna/BrdU+-Zellen innerhalb der neuralen Netzhaut (mit Ausnahme der CMZ und Linsen-/Endothelzellen) wurden gezählt und zwischen nur +Mtz- und +Mtz- und D-Dex-Netzhäuten verglichen.

Tg(rho:YFP Eco. NfsB)gmc500-Larven wurden mit Mtz bei 5 dpf behandelt, und dann wurden die Larven bei 6 dpf mit Tricain anästhesiert, unter einen PLI-100-Picospritzer (Harvard Apparatus) gelegt und mit einer 10-nL-Menge von entweder 5 injiziert μM Dex, D-Dex oder D-Cy5. Die Konzentration wurde im Vergleich zu Free Dex verdoppelt, um der unterschiedlichen Aufnahme bei Injektion im Vergleich zum Einweichen Rechnung zu tragen. Anschließend wurde bei 9 dpf der ARQiv-Scan durchgeführt, um die Regenerationskinetik wie oben beschrieben zu messen. In späteren Experimenten wurde die Injektion mit D-Cy5 durchgeführt, um die Dendrimer-Aktivität in vivo zu beobachten. Die Toxizität dieser Injektionsmethode wurde nach zwei Injektionsversuchen an gleiche Gruppen von 12 Fischen mit Vehikel und verschiedenen Konzentrationen von Free Dex oder D-Dex (enthält äquivalentes Dex in konjugierter Form) bei 5 dpf bestimmt. Über die beiden Zeitpunkte hinweg wurden insgesamt etwa 500 Fische verwendet. Bei 7 dpf wurde der Prozentsatz der überlebenden Fische gezählt (Abb. 2) und der LD50-Wert mit zuvor etablierten Methoden berechnet35.

Die Daten wurden mit GraphPad Prism 9 verarbeitet, um alle Diagramme zu erstellen und statistische Analysen durchzuführen, die von der Software basierend auf der Art der generierten Daten empfohlen werden. Für Tests mit nur zwei Versuchsgruppen (Beispiel: Ergänzende Abbildung 1c zum Vergleich der TUNEL+-Zellfärbung) wurden ungepaarte zweiseitige t-Tests durchgeführt, um p-Werte und Effektgrößen zwischen Gruppen zu identifizieren. Bei den meisten Assays handelte es sich um Vergleiche über mehrere Gruppen hinweg (Beispiel: Abb. 1e). Die in diesen Fällen durchgeführten statistischen Tests waren ungepaarte zweiseitige Welch-ANOVA-t-Tests und beinhalteten eine Mehrfachvergleichskorrektur der p-Werte. Prism wurde auch zur Berechnung der 95 %-Konfidenzintervalle für die Toxizitätskurve (Abb. 2b) unter Verwendung der Kaplan-Meier-Methode verwendet. Alle In-vivo-Experimente wurden unter Verwendung von mindestens drei biologischen Replikaten (transgene Geschwisterfische, die gegebenenfalls zusammen mit dem Arzneimittel in getrennten Medien gehalten wurden) durchgeführt, einschließlich aller Kontroll- und Behandlungsbedingungen. In allen Larvenstadien, in denen Experimente durchgeführt wurden, erfolgte die Geschlechtsbestimmung noch nicht und wurde daher im Versuchsaufbau nicht berücksichtigt, wie dies bei erwachsenen Fischen der Fall wäre.

Für die RNA-Sequenzierung wurden Geschwisterfische mit 5 dpf gmc500 auf YFP-Expression untersucht und in 12 Gruppen aufgeteilt (15 Larven in jeder Probe mit jeweils drei biologischen Replikaten für vier Bedingungen: nur Mtz, Mtz + D-Dex-Injektion, kein Mtz oder kein Mtz). + D-Dex-Injektion). Bei 7 dpf, 24 Stunden nach der Erholung nach 24 Stunden Einweichen mit 10 mM Mtz (für anwendbare Gruppen) und 24 Stunden nach der perikardialen Injektion von 10 nL 2,5 μM D-Dex (für anwendbare Gruppen) wurden von jeder Larve ganze Augen präpariert. Präparierte Augen wurden in Trizol (ThermoFisher Scientific, 15596018) gegeben und die RNA wurde mit dem RNeasy Micro Kit (Qiagen, 74004) extrahiert. Die Proben wurden dann zur Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung an den Deep Sequencing and Microarray Core (Johns Hopkins University) geschickt. Die Proben wurden mit dem ClonTech SMARTer Ultra Low Input RNA-v4-Kit (Takara 634440) gemäß den Anweisungen des Herstellers verarbeitet. Kurz gesagt, cDNA wird aus 10 ng Gesamt-RNA unter Verwendung des Oligo-dT-Primers erzeugt. cDNA wurde amplifiziert und gereinigt. Etwa 150 pg wurden in das Bibliotheksvorbereitungskit Illumina Nextera XT DNA (Illumina FC-131-1096) übernommen. Die Tagmentierung wurde durchgeführt und die Bibliotheken wurden mit einem Illumina-Dual-Indexed-Adapter-Mix amplifiziert. Die Proben wurden gepoolt und auf der NovaSeq 6000 SP 100-Fließzelle, Single-End, 100-bp-Reads, sequenziert, was etwa 50 M Reads/Probe ergab.

Rohe Sequenzierungsdaten (in Form von fasta.gz-Dateien) wurden heruntergeladen und entpackt, und dann wurde die Terminalfunktion cutadapt verwendet, um Nextera-Sequenzierungsadapter zu entfernen (insbesondere wurde die Sequenz CTGTCTCTTATA gekürzt). Anschließend wurden die Proben zur Qualitätskontrolle in fastqc eingelesen, um ordnungsgemäße und ähnlich große Bibliotheken, die vollständige Entfernung von Adaptern und durchgehend hohe Sequenzqualitätswerte sicherzustellen. Die Sequenzierung für jede Probe erfolgte über zwei Spuren und daher wurden die gelesenen Dateien mithilfe der Terminalfunktion „cat“ kombiniert. Die gelesenen Dateien wurden dann mithilfe von Kallisto dem aktuellsten Ensembl-Referenzgenom für Danio rerio GRCz11/danRer11 zugeordnet. Der Prozentsatz der eindeutig zugeordneten Lesevorgänge wurde von fastqc ermittelt und lag für die 15 Proben zwischen 69 und 75 %.

Um differenziell exprimierte Gene (DEGs) zwischen Bedingungen zu identifizieren, wurde eine Matrixdatei mit allen Ensembl-Transkript-IDs und 12 Spalten, eine für jede Probe, in das Paket „edgeR Bioconductor“ (Version 3.34.1) in R/R Studio (Versionen 4.0) eingelesen. 3 bzw. 1.4.1103)74. Kurz gesagt wurde eine Modellmatrix entwickelt, um Daten zwischen drei biologischen Replikaten für jede Erkrankung zu aggregieren. Eine weitere Analyse der Varianz zwischen den Proben ergab für ein Replikat der reinen Mtz-RNA im Vergleich zu den anderen Gruppen Daten von geringer Qualität, weshalb diese Gruppe entfernt wurde. Als nächstes wurden alle möglichen paarweisen Vergleiche zwischen den 4 Proben mit der glmLRT-Methode durchgeführt. Die Daten wurden dann als.csv-Dateien exportiert. Vor der Identifizierung von Treffer-DEGs wurden Kontrollprobenvergleiche verwendet, um Transkripte für interessante Vergleiche herauszufiltern. Schließlich wurden die verbleibenden Transkripte sortiert, um Treffer-DEGs zu identifizieren, die mindestens eine logarithmische Faltungsänderung des Ausdrucks von 1 (eine Ausdrucksfaltungsänderung von 2) in beide Richtungen und mit einer Falscherkennungsrate (FDR) <0,10 zeigten.

Um umfassendere funktionelle Veränderungen bei jeder Erkrankung zu identifizieren, wurde Gene Ontology (GO, http://geneontology.org/docs/go-enrichment-analysis/) verwendet. Für relevante Bedingungspaare wurden Transkript-IDs für Treffergene in BioMart eingegeben, um eine Liste von Gennamen zu erhalten, die dann über GO eingegeben wurden.

Um die bei der RNA-Sequenzierung identifizierten Genexpressionsänderungen zu validieren, wurden einige ausgewählte Gene von Interesse für die qRT-PCR-Analyse identifiziert. YFP-NTR-exprimierende Larven bei 5 dpf wurden gescreent und wie üblich mit Mtz (10 mM, 24 h) ablatiert, und 24 h nach der Entfernung bei 5 dpf wurden ganze Augen auf ~16 Larven aus jedem Zustand präpariert und für die mRNA-Extraktion gepoolt. Ein zuvor veröffentlichtes Protokoll wurde verwendet, um die Genexpression mit qRT-PCR36 zu messen. Kurz gesagt, die RNA wurde mit dem NEB Monarch RNA Cleanup Kit gereinigt und mit dem qScript cDNA Synthese Kit (QuantaBio) revers in cDNA transkribiert. Die quantitative PCR wurde unter Verwendung entworfener Primer mit der primerdb-Datenbank und PowerUp™ SYBR™ Green Master Mix (ABI) in QuantaStudio (ABI) durchgeführt. Eine Delta-Delta-CT-Analyse wurde durchgeführt, um die relative Faltungsänderung der Genexpressionsniveaus zwischen Knockdown-Larven und Kontrollen zu berechnen. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Basierend auf Massen-RNA-Sequenzierungsdaten (insbesondere Hochregulierung von Mtz+D-Dex im Vergleich zu Mtz allein) wurden die Gene kcnj13,rnf, col11a2 und nosip für nachfolgende Funktionstests ausgewählt. Für kcnj13 und rnf2 verwendeten wir ZFIN (zfin.org), um die Expression im Auge sowie bekannte Rollen bei der Funktion des Immunsystems zu bestätigen. CRISPR/Cas9-vermittelte redundante Targeting-Injektionen wurden im Einzelzellstadium von gmc500-Embryonen unter Verwendung der von Lit. veröffentlichten Strategie durchgeführt. 47. Die vier veröffentlichten sgRNAs für jedes Gen wurden als DNA-Oligos bestellt (Supplementary Data 1), mit dem allgemeinen CRISPR-Tracr-Oligo zusammengesetzt und dann mithilfe gepoolter In-vitro-Transkription (HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, New England BioLabs) transkribiert mit dem NEB Monarch RNA Cleanup Kit bereinigt. Eine Mischung aus vier sgRNAs (insgesamt 1 ng) und Cas9-Protein (2,5 µM, IDT) wurde in Rho:YFP-NTR-Embryonen im Einzelzellstadium injiziert, um auf jedes Gen abzuzielen. Mutierte Larven wurden dann demselben Regenerationstest unterzogen, der bei 9 dpf wie oben endete.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

RNA-Sequenzierungsdaten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, wurden bei GEO mit dem Zugangscode GSE216060 hinterlegt. Daten können heruntergeladen werden, indem Sie auf ncbi.nlm.nih.gov/geo gehen und nach dem Zugangscode suchen. Die Quelldaten für die Hauptzahlen sind in den Zusatzdaten 1 und 2 angegeben. Alle übrigen Informationen können auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor eingeholt werden.

Der spezifische Code, der bei der Analyse großer RNA-Sequenzierungsdaten verwendet wird, ist auf Anfrage für Autoren erhältlich.

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Diese Arbeit wurde durch die folgenden Zuschüsse der National Institutes of Health unterstützt: R01OD020376 (JSM), R01EY025304 (RMK), F31EY032790 (KE) und P30EY001765-45 (Hauptzuschuss an das Wilmer Eye Institute). Wir danken den Labors Ramakrishnan und Tobin für die Weitergabe transgener Fische und den Mitgliedern des Mumm-Labors für hilfreiche Diskussionen. Wir danken auch BioRender.com für die Erlaubnis, wissenschaftliche Symbole bei der Erstellung von Abbildungen zu verwenden.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Kevin Emmerich, David T. White, Siva P. Kambhampati.

McKusick-Nathans-Institut der Abteilung für Genetische Medizin, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA

Kevin Emmerich & Jeff S. Mumm

Abteilung für Augenheilkunde, Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA

Kevin Emmerich, David T. White, Siva P. Kambhampati, Grace L. Casado, Zeeshaan Chunawala, Arpan Sahoo, Saumya Nimmagadda, Nimisha Krishnan, Meera T. Saxena, Rangaramanujam M. Kannan und Jeff S. Mumm

Das Zentrum für Nanomedizin, Wilmer Eye Institute, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA

Siva P. Kambhampati, Rangaramanujam M. Kannan und Jeff S. Mumm

Janelia Farms Forschungscampus, Howard Hughes Medical Institute, Ashburn, VA, USA

Tian-Ming Fu & Eric Betzig

Fakultät für Elektrotechnik und Informationstechnik und Princeton Bioengineering Initiative, Princeton University, Princeton, NJ, USA

Tian-Ming Fu

School of Biomedical Sciences, The Chinese University of Hong Kong, Hongkong, China

Steven L. Walker

Solomon H. Snyder Abteilung für Neurowissenschaften, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA

Jeff S. Mumm

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JSM, KE und DTW haben das Projekt entworfen. KE und DTW führten alle Experimente an Zebrafischen durch und verfassten zusammen mit JSM das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren. SPK und RMK überwachten die Entwicklung nanopartikelkonjugierter Arzneimittel und trugen zur Gestaltung entsprechender Experimente bei. T.-MF und EB beaufsichtigten und führten AO-LLSM-Bildgebungsexperimente durch, während JSM und KEKE die RNA-Sequenzierung und -Analyse durchführten, mit Unterstützung bei der Analyse von ZC, SLW und SNNK, GLC und AS, die bei der konfokalen Mikroskopie-Bildgebung unterstützt wurden. Analysis trug zusammen mit KE und DTWMTS zum Verfassen und Bearbeiten von Manuskripten bei.

Korrespondenz mit Eric Betzig, Rangaramanujam M. Kannan oder Jeff S. Mumm.

JSM hält Patente für das NTR-induzierbare Zellablationssystem (US-Nr. 7.514.595) und dessen Verwendung (US-Nr. 8.071.838 und US-Nr. 8431768). RMK und SPK haben ausstehende Patente für die Hydroxyl-Dendrimer-Plattform für Augentherapien erhalten. RMK und seine Frau (Sujatha Kannan) sind Mitbegründer/Vorstandsmitglieder und haben finanzielle Interessen an Ashvattha Therapeutics Inc., einem Start-up, das sich auf die klinische Umsetzung der Dendrimer-Plattform konzentriert. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Communications Biology dankt Andy Fischer und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Eirini Trompouki und Anam Akhtar. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Emmerich, K., White, DT, Kambhampati, SP et al. Nanopartikelbasiertes Targeting von Mikroglia verbessert die neuronale Regeneration und verstärkt die Wirkung der Immunsuppression in der Netzhaut des Zebrafisches. Commun Biol 6, 534 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04898-9

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Eingegangen: 22. Februar 2021

Angenommen: 02. Mai 2023

Veröffentlicht: 18. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04898-9

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